用于牙科应用的人工唾液溶液中的 CoCrW 合金

为了评估其作为假牙材料的应用，在人工唾液和 0.15 mol.L-1 NaCl 介质中对 CoCrW 合金进行了体外细胞毒性测试、表面表征和电化学研究。使用的技术有：阳极极化曲线、计时电流测量、电化学阻抗谱 (EIS)、扫描电子显微镜 (SEM)、能量色散 X 射线光谱 (EDS) 分析和 X 射线光电子能谱 (XPS)。还进行了细胞毒性试验。比较 CoCrW 合金在两种研究介质中的电化学行为，从腐蚀电位 (Ecorr) 到 600 mV 阳极过电压。从电化学测量中观察到，两种介质中的 CoCrW 合金仅呈现普遍腐蚀。 SEM和EDS分析表明，该合金存在碳化铌和硅锰氧化物作为非金属夹杂物。 XPS 结果表明钴对钝化膜的形成没有显着贡献。细胞毒性试验表明 CoCrW 合金没有细胞毒性。这些结果表明 CoCrW 合金可用作生物材料，用作牙种植体中的假体。

介绍

由于其机械性能，金属合金自 20 世纪初就被用作牙科材料 (1,2)。如今，由于经济问题，非贵重合金在牙科领域正在取代贵重合金。牙科用非贵金属合金表面有一层薄的钝化氧化物膜。这种钝化膜必须具有高附着力、致密性、高电阻和无裂纹等缺陷 (1,2)。

口腔环境非常适合促进金属材料的氧化。唾液的数量和质量、唾液 pH 值、牙菌斑、蛋白质含量、食物和液体摄入的化学和物理特性以及一般口腔健康状况等因素可能会影响口腔中的金属腐蚀 (3)。口腔环境中的牙科材料有两个问题：腐蚀产物释放到身体引起的局部效应或全身性损伤以及对合金物理性能和临床性能的影响（4-7）。

CoCr 基合金已用于假牙，因为它们具有良好的耐腐蚀性 (8,9)。最近，已经开发出钨含量高的合金而不是钼，旨在提高陶瓷-金属的附着力 (10)。另一方面，与 CoCrW 合金 (13,14) 相比，CoCrMo 合金得到了更多的研究 (4-12)。

     在这项工作中，在人工唾液和 0.15 mol.L-1 NaCl 介质中对 CoCrW 合金进行了体外细胞毒性测试、表面表征和电化学行为，以评估其作为假牙材料的应用。为了表征合金表面，使用极化曲线、计时电流法、电化学阻抗谱（EIS）、扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDS）和X射线光电子能谱。还进行了体外细胞毒性试验，以研究拟议合金作为植入材料的生物相容性。

材料与方法

样品和解决方案

CoCrW合金的化学成分见表1。

人工唾液的成分由三种不同的溶液制备。 使用以下试剂/浓度 (mol.L-1)： 溶液 A：

 表1 CoCrW 合金的化学成分 (wt )

NaH2PO4/0.233 + KCl/1.164 + NaCl/0.123 + NH4Cl/0.205

+ 柠檬酸钠/3.74x10-3 + 乳酸/0.039； 溶液 B-尿素/0.167 + 尿酸/4.46x10-3 + NaOH/5x10-3 和溶液 C：KSCN/0.123。 通过混合 A、B 和 C 溶液 (1:1:1) 每天制备唾液溶液，然后在高纯度去离子水 (15) 中稀释 50 倍。

所有实验均使用自然曝气溶液在 (37.0±0.5) °C 和 6.6 pH 值（口腔条件）下进行三次重复。

电极

CoCrW 合金工作电极是由棒的中心部分制成的圆盘，面积为 0.90 cm2。 圆柱形环氧树脂底座与钢盘配合。 一根同心黄铜棒连接到钢+环氧树脂基体上。 通过依次用更细等级的 120、400、600 和 2000 目砂纸抛光制备电极，然后在实验前用蒸馏水和乙醇彻底冲洗并风干。

辅助电极由铂箔组成，每次实验前都用酸清洗并燃烧。 饱和甘汞电极（SCE）用作参比电极。

电化学实验

通过动电位极化阳极曲线和计时电流曲线评估耐腐蚀性。 所研究的 CoCrW 合金在人工唾液和 0.15 mol.L-1 NaCl 溶液中。 这些评估是在每个电位应用达到恒定电流后进行的，从阳极方向上的开路电位开始，从 Ecorr 到 0.9 V vs. SCE，使用 1 mV.s-1 扫描速率。 作为工作标准，假设当电流密度为 10 mA/cm2 时达到跨钝化电位。 电化学阻抗谱 (EIS) 测量在 8 个十倍频（从 100 KHz 到 10 mHz）进行。 潜力是

±8 mV, p.p. 实验在 37 °C 下进行。 一种

μAutolab type III/FRA2 恒电位仪（Metrohm Autolab BV，荷兰）用于与频率响应检测器和微型计算机耦合。

表 2. 使用能量色散光谱 (EDS) 分析 CoCrW 的不同表面区域抛光后的合金

表面表征

扫描电子显微镜 (SEM) 和能量色散 X 射线光谱 (EDS) 分析

SEM 和 EDS 分析在与 Stereoscan 440 Leica 扫描电子显微镜（Leica Microsystems）耦合的 WDX600 牛津显微镜（Leica Microsystems. Wetzlar，德国）上进行。 样品使用 1 μm 金刚石膏抛光，用水和乙醇冲洗并风干。 使用 EDS 分析了不同的表面区域（表 2）。

X 射线光电子能谱 (XPS) 分析

XPS 分析在光谱仪（型号 XSAM HS；Kratos Analytical Ltd, Manchester, UK）上在超高真空（约 10-8 Torr）下进行。非单色 Mg Kα (hν=1253.6 eV) 辐射用作 X 射线源，在 12 kV 电压下具有 5 mA 发射电流。将样品抛光，用去离子水冲洗，在超声波浴中用分析级丙酮清洗 5 分钟，然后用去离子水冲洗。在这些实验之前，将样品在 Ecorr 浸入人造唾液和 0.15 mol.L-1 NaCl 溶液中 8 小时。 8 小时后，分析表面成分以研究钝化膜成分中钴 (Co) 和铬 (Cr) 的存在。作为结合能参考值，对应于外来烃 (16) 的碳峰的值是 284.8 eV。评估包括用于背景扣除的 Shirley 程序、混合高斯/洛伦兹函数和用于拟合峰值的最小二乘程序。

表面表征

扫描电子显微镜 (SEM) 和能量色散 X 射线光谱 (EDS) 分析

SEM 和 EDS 分析在与 Stereoscan 440 Leica 扫描电子显微镜（Leica Microsystems）耦合的 WDX600 牛津显微镜（Leica Microsystems. Wetzlar，德国）上进行。 样品使用 1 μm 金刚石膏抛光，用水和乙醇冲洗并风干。 使用 EDS 分析了不同的表面区域（表 2）。

X 射线光电子能谱 (XPS) 分析

XPS 分析在光谱仪（型号 XSAM HS；Kratos Analytical Ltd, Manchester, UK）上在超高真空（约 10-8 Torr）下进行。非单色 Mg Kα (hν=1253.6 eV) 辐射用作 X 射线源，在 12 kV 电压下具有 5 mA 发射电流。将样品抛光，用去离子水冲洗，在超声波浴中用分析级丙酮清洗 5 分钟，然后用去离子水冲洗。在这些实验之前，将样品在 Ecorr 浸入人造唾液和 0.15 mol.L-1 NaCl 溶液中 8 小时。 8 小时后，分析表面成分以研究钝化膜成分中钴 (Co) 和铬 (Cr) 的存在。作为结合能参考值，对应于外来烃 (16) 的碳峰的值是 284.8 eV。评估包括用于背景扣除的 Shirley 程序、混合高斯/洛伦兹函数和用于拟合峰值的最小二乘程序。

细胞毒性试验

通过在与合金样品接触后将细胞培养物暴露于溶液中进行细胞毒性测定，在 37°C 的培养基 MEM 中浸泡 10 天。 NCTC 克隆 929 细胞系购自美国典型培养物保藏中心 (ATCC) 库。 根据国际标准化组织 (ISO) (19)，在之前的论文 (17,18) 中描述了中性红吸收 (NRU) 方法，评估了细胞毒性效应。

结果

电化学结果

人工唾液和 0.15 mol.L-1 NaCl 溶液的腐蚀电位（固定开路电位值）为

-100±28 mVSCE 和 -277±23

mVSCE 分别（图 1A）。阳极动电位极化曲线由腐蚀电位获得并绘制，以评估电位的影响，以确定合金钝化的电位范围和跨钝化电位的值。进行计时电流测试是为了验证钝化膜上是否存在点蚀。从极化曲线获得的结果绘制在图 1A 中，其中合金的计时电流曲线在不同的电位值（图 1B 和 1C），分别在人工唾液和 NaCl 介质中。计时电流结果显示在不同的电位下，并证实了通过动电位极化阳极曲线获得的结果，表明金属表面钝化的电位范围。在不同电位值下观察到的电流密度恒定值表明合金不存在点腐蚀。

EIS 被用来研究钝化膜/电解质界面和随电位增加的演变。图 2 显示了 CoCrW 在人工唾液（图 2A）和 0.15 mol.L-1 NaCl 溶液（图 2B）中 Ecorr 和 0.25 VSCE 的 Bode（模量和相）图。对于两种介质中的合金/溶液界面，可以看到类似的行为：阻抗的虚部和实部随着电位变得比 Ecorr 更正而减少。建议的等效电路如图 2C 所示，

其中 R 对应于电解质电阻，CPE 和 Rf 分别对应于恒相元件（伪电容）和通过保护膜氧化反应的极化电阻。CPEdc 和 Rct 分别对应于双层恒相CoCrW 合金氧化的元素和电荷转移电阻。在两种媒体中为 Ecorr 和 0.25 VSCE 提出了相同的电路。

表面表征

      进行SEM和EDS分析以评估非金属夹杂物的存在。抛光后使用 EDS 分析不同的表面区域

1 mm 钻石膏。图 3 显示了三个不同的区域，1、2 和 3。根据 EDS 分析，区域 1 表示整体成分，区域 2 对应于碳化铌，区域 3 是由于存在硅和锰氧化物。

XPS 用于研究钝化膜成分中 Cr 和 Co 的存在。表 3 显示了钝化膜中元件的绝对电位。表面的铬含量在两种介质中都高于钴，与唾液相比，在 0.15 mol.L-1 NaCl 中更高。结果表明钝化膜中存在铬 (III) 和钴氧化物。

细胞毒性试验

     进行细胞毒性试验，结果见图4；细胞毒性评价采用中性红吸收法。阳性和阴性对照用于确认测试程序的适当性能和/或评估 CoCrW 合金的结果，以及控制电池灵敏度、提取效率和其他测试参数。细胞活力高于 IC50( ) 线的样品被认为是无毒的，低于 IC50( ) 线的样品是有毒的。

讨论

     图 1A 显示盐水溶液中的 Ecorr 更正，表明与人工唾液介质相比，形成更好的被动膜。 CoCrW 合金（图 1A）在大的分析电位范围内显示出较小的电流密度值（1 至 10 µA/cm2），表明在两种介质中形成的钝化膜具有良好的特性。 CoCrW 合金在 NaCl 介质中表现出较低的钝化电流密度，表明氯化钠的钝化膜比人工唾液中的钝化膜更多。计时电流曲线（图 1B 和 1C）即使在高电位下也显示出恒定的电流密度值，表明没有点腐蚀。结果表明，CoCrW 合金在 0.9 V 和两种介质中的高电流密度值下仅呈现普遍腐蚀。

   通过 EIS 在 Ecorr 和 0.25 VSCE 下研究了钝化膜的特性。结果示于图2A和2B中。波特相图是典型的无源系统，在低频时阻抗的实部和虚部均具有高值。在波特图中 |Z| 的值约为 105 Ω/cm² 且角度大于 75º，显示形成的薄膜具有高阻容特性。波特相图指出了人工唾液和氯化钠的相同机制。图 2C 还显示了根据模拟等效电路对实验结果的拟合。在整个研究频率范围内观察到实验结果和所提出的等效电路之间的良好一致性，表明两种介质中的定性机制相同。在氯化钠介质中形成的膜（图 2B）比在人工唾液中形成的膜（图 2A）具有更好的质量。

钝化膜的成分由 Ecorr 的 XPS 分析。氯化钠中形成的钝化膜中铬和钴的含量比人工唾液中的多。保护膜由两种介质（20）中的氧化铬形成。 Hodgson 等人也获得了这些结果。 (21)。在 CoCr 基合金中，只有在高电位时才会发现铬氧化的另一种状态，如 Cr (VI) (21,22)。 Co2+ 和 Co3+ 之间的化学位移非常小 (22-24)，表明难以表征金属表面的氧化态。薄膜中的少量钴表明它扩散到溶液中并且没有显着贡献到氧化物相。

在这项研究中，测试合金即使在 100 提取物浓度下也没有出现毒性作用。所有活力曲线均高于细胞毒性指数线，这意味着 CoCrW 合金在该测定中没有显示出细胞毒性效应。在这项研究中，CoCrW 合金表现出良好的行为，形成了富含铬 (III) 氧化物和少量钴氧化物的均匀钝化膜。在 0.15 mol.L-1 NaCl 中形成的薄膜比在人工唾液中形成的薄膜更具电容性和电阻性。人工唾液的化学复杂性可能导致钝化膜的更大不稳定性。 SEM 和 EDS 表明 CoCrW 合金呈现碳化铌和硅和锰的氧化物作为非金属夹杂物。细胞毒性试验验证了非细胞毒性

根据所使用的方法对合金的影响。

这项研究的结果表明，从电化学和细胞毒性的角度来看，CoCrW 合金可用作生物材料，用于种植牙假体。

图1所示。CocrW合金在唾液中的电位、极化曲线。在每一个潜在的应用中，7r B和C的摩尔氯化物显示了时间的变化。

细胞毒性试验

通过在与合金样品接触后将细胞培养物暴露于溶液中进行细胞毒性测定，在 37°C 的培养基 MEM 中浸泡 10 天。 NCTC 克隆 929 细胞系购自美国典型培养物保藏中心 (ATCC) 库。 根据国际标准化组织 (ISO) (19)，在之前的论文 (17,18) 中描述了中性红吸收 (NRU) 方法，评估了细胞毒性效应。

结果

电化学结果

人工唾液和 0.15 mol.L-1 NaCl 溶液的腐蚀电位（固定开路电位值）为

-100±28 mVSCE 和 -277±23

mVSCE 分别（图 1A）。阳极动电位极化曲线由腐蚀电位获得并绘制，以评估电位的影响，以确定合金钝化的电位范围和跨钝化电位的值。进行计时电流测试是为了验证钝化膜上是否存在点蚀。从极化曲线获得的结果绘制在图 1A 中，其中合金的计时电流曲线在不同的电位值（图 1B 和 1C），分别在人工唾液和 NaCl 介质中。计时电流结果显示在不同的电位下，并证实了通过动电位极化阳极曲线获得的结果，表明金属表面钝化的电位范围。在不同电位值下观察到的电流密度恒定值表明合金不存在点腐蚀。

EIS 被用来研究钝化膜/电解质界面和随电位增加的演变。图 2 显示了 CoCrW 在人工唾液（图 2A）和 0.15 mol.L-1 NaCl 溶液（图 2B）中 Ecorr 和 0.25 VSCE 的 Bode（模量和相）图。对于两种介质中的合金/溶液界面，可以看到类似的行为：阻抗的虚部和实部随着电位变得比 Ecorr 更正而减少。建议的等效电路如图 2C 所示，

图2。() CoCrW合金在氯化钠(A)和人工唾液下的阻抗空间。等效电路用于拟合不同电势下的实验数据。

其中 R 对应于电解质电阻，CPE 和 Rf 分别对应于恒相元件（伪电容）和通过保护膜氧化反应的极化电阻。CPEdc 和 Rct 分别对应于双层恒相CoCrW 合金氧化的元素和电荷转移电阻。在两种媒体中为 Ecorr 和 0.25 VSCE 提出了相同的电路。

表面表征

      进行SEM和EDS分析以评估非金属夹杂物的存在。抛光后使用 EDS 分析不同的表面区域

1 mm 钻石膏。图 3 显示了三个不同的区域，1、2 和 3。根据 EDS 分析，区域 1 表示整体成分，区域 2 对应于碳化铌，区域 3 是由于存在硅和锰氧化物。

XPS 用于研究钝化膜成分中 Cr 和 Co 的存在。表 3 显示了钝化膜中元件的绝对电位。表面的铬含量在两种介质中都高于钴，与唾液相比，在 0.15 mol.L-1 NaCl 中更高。结果表明钝化膜中存在铬 (III) 和钴氧化物。

 表 3 浸渍后 CoCrW 合金的 X 射线光电子能谱 (XPS) 结果

图 3. 通过 1 毫米金刚石膏抛光的 CoCrW 合金样品的 SEM 和 EDS 图像。

细胞毒性试验

     进行细胞毒性试验，结果见图4；细胞毒性评价采用中性红吸收法。阳性和阴性对照用于确认测试程序的适当性能和/或评估 CoCrW 合金的结果，以及控制电池灵敏度、提取效率和其他测试参数。细胞活力高于 IC50( ) 线的样品被认为是无毒的，低于 IC50( ) 线的样品是有毒的。

讨论

     图 1A 显示盐水溶液中的 Ecorr 更正，表明与人工唾液介质相比，形成更好的被动膜。 CoCrW 合金（图 1A）在大的分析电位范围内显示出较小的电流密度值（1 至 10 µA/cm2），表明在两种介质中形成的钝化膜具有良好的特性。 CoCrW 合金在 NaCl 介质中表现出较低的钝化电流密度，表明氯化钠的钝化膜比人工唾液中的钝化膜更多。计时电流曲线（图 1B 和 1C）即使在高电位下也显示出恒定的电流密度值，表明没有点腐蚀。结果表明，CoCrW 合金在 0.9 V 和两种介质中的高电流密度值下仅呈现普遍腐蚀。

   通过 EIS 在 Ecorr 和 0.25 VSCE 下研究了钝化膜的特性。结果示于图2A和2B中。波特相图是典型的无源系统，在低频时阻抗的实部和虚部均具有高值。在波特图中 |Z| 的值约为 105 Ω/cm² 且角度大于 75º，显示形成的薄膜具有高阻容特性。波特相图指出了人工唾液和氯化钠的相同机制。图 2C 还显示了根据模拟等效电路对实验结果的拟合。在整个研究频率范围内观察到实验结果和所提出的等效电路之间的良好一致性，表明两种介质中的定性机制相同。在氯化钠介质中形成的膜（图 2B）比在人工唾液中形成的膜（图 2A）具有更好的质量。

图 4. CoCrW 合金在中性红吸收方法的细胞毒性测定中的活力曲线。

钝化膜的成分由 Ecorr 的 XPS 分析。氯化钠中形成的钝化膜中铬和钴的含量比人工唾液中的多。保护膜由两种介质（20）中的氧化铬形成。 Hodgson 等人也获得了这些结果。 (21)。在 CoCr 基合金中，只有在高电位时才会发现铬氧化的另一种状态，如 Cr (VI) (21,22)。 Co2+ 和 Co3+ 之间的化学位移非常小 (22-24)，表明难以表征金属表面的氧化态。薄膜中的少量钴表明它扩散到溶液中并且没有显着贡献到氧化物相。

在这项研究中，测试合金即使在 100 提取物浓度下也没有出现毒性作用。所有活力曲线均高于细胞毒性指数线，这意味着 CoCrW 合金在该测定中没有显示出细胞毒性效应。在这项研究中，CoCrW 合金表现出良好的行为，形成了富含铬 (III) 氧化物和少量钴氧化物的均匀钝化膜。在 0.15 mol.L-1 NaCl 中形成的薄膜比在人工唾液中形成的薄膜更具电容性和电阻性。人工唾液的化学复杂性可能导致钝化膜的更大不稳定性。 SEM 和 EDS 表明 CoCrW 合金呈现碳化铌和硅和锰的氧化物作为非金属夹杂物。细胞毒性试验验证了非细胞毒性

根据所使用的方法对合金的影响。

这项研究的结果表明，从电化学和细胞毒性的角度来看，CoCrW 合金可用作生物材料，用于种植牙假体。